IWA微信公众号此前曾在多篇推送中介绍过有关对污水中新冠病毒进行监测的研究和实践。荷兰是最早在污水中发现新冠病毒RNA片段的国家之一。荷兰KWR水循环研究所正是背后的推动力。他们有一支研究团队早在2017年就开始研究基于第二代测序技术(NGS)在水管理的应用潜力。经过这几年的科研积累，荷兰率先在污水中检测新冠病毒也是合情合理的事。
　　第二代DNA测序技术又称下一代测序技术(Next-Generation Sequencing, 简称NGS)。所谓第二代，是相对较早出现的Sanger双脱氧核苷酸测序技术（简称Sanger测序）而言的。其实NGS技术早在2005年前后就面世了，凭借其超高通量、可扩展性和速度等特点，如今已成为生物与医学研究的常见通用工具。

　图. NGS测序技术的流程原理图 | 图源：Pinterest
　　近几年，NGS技术在污水处理领域的应用也愈发普及。借助NGS技术，我们可以对单细胞和单细菌进行测序，也可以分析水中的DNA信息，了解到污水中的微生物组成。这为水务部门提供了新的监测和管理工具。虽然我们印象中的荷兰有着一流的水务管理经验，但在他们自己的水务部门看来，荷兰的地表水的水质目前也遭受到压力，其中包括了污水管网的溢流以及污水厂出水排放的影响，因为污水中可能会含有粪便或者其他有害微生物。
　　地表水、污水厂的进水和出水、地下水都有它们各自的微生物组成，或者称独一无二的微生物指纹。基于NGS技术得到的DNA指纹图谱是否适用于识别微生物污染物并检测出污染源的位置呢？
　　从管理者的角度而言，精准找出污染源头是解决任何污染问题的关键一步。所以荷兰的水务管理者，包括地方政府和水委会，对以下四个问题非常感兴趣。
　　是否可以污水监测溢流对地表水的影响？是否可队特定溢流进行追溯？
　　污水处理厂的污水排放是否可追溯？如果可以的话，最远追溯距离是多少？
　　污水厂出水或者曝气池的污水泄漏到地下水的话，可追溯的最远距离是多少？
　　是否可以追溯某一地表水源流入其它地表水源（例如洪水蓄水池）的方向？
　　基于以上问题，荷兰的KWR水循环研究所联合多个地方水委会，开展了相关研究。该项目得到了荷兰经济部和荷兰的知识和创新顶级联盟（TKI）的联合资助。在本期的微信推送里，我们将带大家了解他们的研究结果。

　研究方法及设计
　　通俗点说，无论是用第一代还是第二代的测序技术，都能得到一个细菌或者一个种群的指纹图谱，只是新一代的技术灵敏度更高，测得更准确、样本量更少、完整度更好。总的来说，就是NGS技术更简单却更便宜，自然吸引更多科学家应用到其具体细分领域里。
　　在本研究中，研究团队从荷兰五个污水处理厂32个点进行采样，涵盖了其进水、出水以及地表水的样品。针对第三个问题，他们还从污水厂的曝气池和四个地下水监测井中取样。采样时间分为2017年6-11月和2018年3-9月两个阶段。
　　分析工作分为三步，首先是用NGS测序技术来测定特定DNA序列，然后再用生物信息学软件来建立相关微生物的DNA指纹，最后用源头跟踪工具来判断微生物指纹图谱的来源类型。
　　测定微生物DNA指纹
　　每个采样点都取其平均值作为结果。下图1显示了最常见的25种细菌在进水和出水的平均丰度。进水有着非常典型的微生物群落，它们主要源自人和动物肠道的粪便微生物和在污水中滋生的细菌，包括杆状杆菌(Arcobacter)，不动杆菌(Acinetobacter)，气单胞菌(Aeromonas)和滴虫(Trichococcus)。其中出水的特征微生物群中Saccharimonadales、Neisseriaceae和Fodinicola等细菌。和进水的情况不同的是，每个污水处理厂出水的DNA指纹特征差异更大。

　　图. 污水处理厂进出水的“微生物指纹图”。在两类样品中都能找到25种最常见的微生物属。各种微生物的出现程度用多个采样点的相对丰度平均值表示。
　　对四个问题的回答
　　问题1: 污水溢流的追踪
　　分析结果显示，污水溢流的微生物指纹图谱很有辨识度，因此可以确定特定地表水水体受溢流影响的程度。他们还和威斯康星大学密尔沃基分校的McLellan教授等人一篇综述进行对比，发现不仅荷兰下水道的污水的图谱很稳定，美国、澳大利亚、巴西、甚至中国等地的污水管网的情况也类似。因此他们通过这些指示细菌对污水进行跟踪是可行的。
　　但由于这类污水在不同地方和采样点的图谱如此接近，以致在有多个地方发生溢流的时候，无法精确找出溢流的位置。他们认为一个解决方案是在靠近溢流点的位置进行采样，还可能继而算出溢流频率。
　　问题2: 污水厂出水的追踪
　　污水厂的出水能追踪到多远？针对这个问题，他们对污水厂出水排入的径流和该径流汇入的另一条径流设置了5个监测点。下图是采样结果。他们在径流1的污水厂出水排放点的上游和下游分别设置了一个采样点。他们使用的一个溯源工具(Source Tracker Tool)分析显示，上游离排放点750米的采样点1和排放点图谱接近度有41%。他们无法确定是受到下游污水厂排放点影响还是该点的上游还有其他污水厂。而下游离2000米的采样点图谱和排放点图谱有接近度达70%。他们还指出，采样时间和季节的变化会显著影响微生物的组成。
　　采样点4是径流1和径流2交汇点的上游，采样点5则是交汇点的下游2000米的位置。尽管有55%的相似度，但实际上我们可以认为点4是不受污水厂排放点影响的。采样点5的结果则说明了在距离污水厂4公里外的径流依然会受到污水厂排放的影响。
　　通过上述结果，虽然我们看到微生物指纹图谱可以反映污水厂出水确实对地表水水质造成影响。但由于上游水质受其他不确定因素干扰，貌似目前的技术似乎还很难反推某座污水厂对下游水质的影响程度。

　图. 5个测量点的微生物指纹图谱。污水厂的出水排入径流1，径流1汇入径流2。通过溯源工具制作这5个点的特征菌属的组成情况。
　　问题3: 可以追踪污水泄漏地下水的情况吗?
　　NGS技术能不能测定某座污水厂的污水泄漏影响地下水的情况? 分析结果显示，在地下水里(监测井)能发现污水厂进水、出水和曝气池的微生物图谱。他们认为这表示污水厂存在泄漏或渗漏情况。值得注意的是，此前的氨氮和COD分析结果显示不存在泄漏问题。基于这点反差，作者认为会有更多管理者有兴趣用微生物指纹法来检查渗漏情况。
　　问题4: 能否追踪混合地表水?
　　虽然分析结果显示水系统的DNA指纹图谱有各自的特征，但它们会受时间变化。目前这个问题尚无确切答案。作者认为需要对不同季节的水进行采样，来了解时间对水质和微生物构成的影响，从而得到更加准确的指纹图谱。
　　展望
　　这个项目初步显示了利用微生物指纹图谱进行水污染溯源的可行性。为了进一步验证其可行性，作者认为下一步需要和传统的微生物水质监测方法进行对比，例如大肠杆菌和肠球菌菌落计数等。另一方面，他们认为需要考察数据的可定量程度，然后结合传统的运行参数进行比对，包括流量、氮磷负荷等，确认NGS技术和现有参数的关联程度。更深入的问题可能是：污水厂出水排入地表水体后，其微生物种群如何演变？一个具有健康生态的水体的微生物最优组成应该是怎么的？
　　KWR希望继续探索NGS作为水质监测工具的潜力，以便更好地定义它的功能界限，让其为污水处理厂管理水平的提升做出贡献。
　　参考资料
　　https://www.h2o-watermatters.com/#
　　https://www.kwrwater.nl/wp-content/uploads/2017/07/Poster-TKI-fingerprint.pdf
　　https://www.circonomist.com/general/dna-fingerprinting-powerful-monitoring-tool-in-water-management/
　　https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166918302076
　　https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22419485/